Đang tải...
Pha tĩnh trong cột sắc ký lỏng
Các phương pháp sắc ký là các phương pháp tách các hợp chất trong một hỗn hợp ra khỏi nhau, sau đó tuần tự định danh cũng như định lượng các hợp chất đó bằng cách ghi nhận các peak sắc ký tại đầu dò. Các hợp chất trong hỗn hợp khi đi vào cột sẽ lưu giữ trong cột sắc ký và bị dòng pha động lôi kéo đi, do tương tác giữa hợp chất với pha tĩnh và pha động là khác nhau mà thời gian lưu của từng hợp chất trên cột sắc ký sẽ khác nhau và dần dần tách ra khỏi nhau. Sau khi đi ra khỏi cột, các phân tích tiếp tục di chuyển đến đầu dò, tùy vào hợp chất cần phân tích mà sử dụng các loại đầu dò khác nhau để phù hợp với nhu cầu phân tích.
Hình 1: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Sciex.
Trong sắc ký lỏng, pha tĩnh được liên kết lên các hạt nhồi rắn. Trong đó, người ta thường chia làm pha tĩnh thành hai nhóm là sắc ký pha đảo và sắc ký pha thuận. Đối với sắc ký pha thuận, pha tĩnh là có tính chất phân cực. Ngược lại, đối với sắc ký pha đảo, các hạt pha tĩnh là các hạt nhồi -SiO2 được phủ các gốc chức không phân cực đến ít phân cực lên bề mặt. Tùy thuộc vào mức độ phân cực người dùng mong muốn mà bề mặt pha tĩnh sẽ được phủ các dây hydrocarbon có chiều dài khác nhau (C2, C8 hoặc C18; đôi khi người ta gắn thêm một số nhóm chức phân cực lên các dây hydrocarbon cho một số cột đặc trưng).
Trong sắc ký lỏng pha đảo, pha động là các dung môi ít phân cực đến phân cực. Ba dung môi được sử dụng nhiều nhất trong HPLC pha đảo là Acetonitrile (ACN), Methanol (MeOH) và nước (H2O). Tùy thuộc vào độ mạnh của pha động mong muốn, người ta trộn các dung môi này với nhau theo các tỉ lệ (có thể chạy đẳng dung môi trong suốt quá trình phân tích hoặc chế độ gradient tỉ lệ dung môi để làm thay đổi độ mạnh pha động trong quá trình chạy).
Trong sắc ký, để đánh giá hiệu năng cột, ta có khái niệm đĩa lý thuyết.
Đĩa lý thuyết là một giá trị lý thuyết, người ta xem tại đó nồng độ chất phân tích trong pha động và nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh đạt trạng thái cân bằng. Số đĩa lý thuyết càng nhiều thì hiệu năng của cột càng tốt. Càng nhiều đĩa lý thuyết thì peak sắc ký càng hẹp, khi đó nếu có 2 peak ở nhau thì sẽ tách ra khỏi nhau.
Đường cong Van deemter
Phương trình Van Deemter trong phép sắc ký liên quan đến phương sai trên một đơn vị chiều dài của một cột phân tách với vận tốc pha động tuyến tính bằng cách xem xét các đặc tính vật lý, động học và nhiệt động lực học của quá trình tách peak. Các tính chất này bao gồm các quãng đường di chuyển của chất phân tích trong cột, khuếch tán (chủ yếu theo chiều dọc), và quá trình truyền khối giữa các pha tĩnh và di động. Độ sai lệch trên một đơn vị chiều dài của cột được tính như là tỷ số của chiều dài cột đến hiệu quả cột trong các đĩa lý thuyết. Phương trình Van Deemter là một hàm hyperbolic tiên đoán rằng có vận tốc tối ưu ở đó sẽ có sự khác biệt nhỏ nhất trên mỗi cột đơn vị và do đó hiệu suất tối đa.
Khuếch tán dọc (B – Longitudinal diffusion)
Khuếch tán là quá trình chất di chuyển từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp hơn với tốc độ tỉ lệ với sự chênh lệch nồng độ và hệ số khuếch tán của chất phân tích. Sự khuếch tán này diễn ra theo chiều dọc của cột và song song với đường đi của pha động. Chất phân tích sẽ di chuyển từ trung tâm có nồng độ chất phân tích cao đến vùng có nồng nộ thấp về phía trước và phía sau của vị trí chất phân tích trong cột. Hiện tượng khuếch tán dọc là nguyên nhân của sự bành rộng peak.
Truyền khối (C – Mass transfer)
Vì pha tĩnh là chất rắn nên hệ số truyền khối pha tĩnh tỉ lệ thuận với thời gian để những cấu tử bị hấp phụ hoặc giải hấp, hay tỉ lệ nghịch hằng số tốc độ bậc nhất của các quá trình này. Sự chuyển động của phân tử trong pha tĩnh tiêu tốn một thời gian dài hơn, peak bành rộng hơn. Pha động đi qua cột càng nhanh tốc độ truyền khối trong pha tĩnh càng nhỏ thì peak càng bành rộng hơn. Những chất lỏng ít nhớt hơn có thể được chọn làm pha động để tăng hệ số khuếch tán. Có thể giảm độ dày pha tĩnh nhưng dung lượng cột sẽ bị giảm.
Khuếch tán dòng xoáy (A – Eddy diffusion)
Các cấu tử đi theo dòng pha động đi xuyên qua pha tĩnh được nhồi trong cột và đi các con đường khác nhau qua một đơn vị chiều dài cột. Sự khuếch tán dòng xoáy phụ thuộc vào đường kính hạt nhồi trong pha tĩnh và cách chúng được nhồi trong cột. Các cấu tử gần sát thành và đi đường ngắn sẽ di chuyển nhanh hơn và được rửa ra trước, các cấu tử đi đường dài quanh co sẽ được rửa giải ra sau. Khi kích thước hạt lớn, sự khuếch tán dòng xoáy càng diễn nhiều cần sử dụng cột có kích thước hạt nhồi nhỏ và độ đồng đều cao. Đây cũng là nguyên nhân dẫn tới bành rộng pic của mỗi chất tan, tín hiệu giảm.
Cấu trúc pha tĩnh poroshell và coreshell
Việc giảm kích thước hạt pha tĩnh hoặc tăng chiều dài cột sắc ký là những biện pháp thường được sử dụng để tăng số đĩa lý thuyết của cột. Tuy nhiên, nhược điểm của hai cách làm này là nó làm tăng áp suất qua cột, đôi khi thậm chí vượt quá khả năng chịu áp của hệ thống.
Có một cách đơn giản hơn, đó là thay đổi độ xốp của hạt pha tĩnh bằng cách sử dụng các hạt pha tĩnh có cấu trúc coreshell.
Các hạt pha tĩnh luôn luôn phải có một độ xốp nhất định để hấp phụ các hợp chất trên bề mặt của nó. Tuy nhiên, khi hạt càng xốp, quá trình truyền khối diễn ra càng kém. Chất phân tích bị hấp phụ vào các hạt pha tĩnh bị dòng pha động rửa giải chậm đi khi pha tĩnh càng xốp. Điều đó dẫn đến peak bị bè rộng như đã nói như phần trên.
Người ta thay đổi bằng cách giảm độ xốp của vật liệu bằng cách sử dụng phần lõi silica có độ đặc cao hơn và phần pha tĩnh chỉ được một lớp phía bên ngoài như trên hình 9, từ đó làm giảm đáng kể quá trình truyền khối diễn ra trong cột.
Khi so sánh với các hạt pha tĩnh truyền thống trước đây sử dụng loại xốp hoàn toàn, dù cùng kích thước hạt pha tĩnh, nhưng lại cho số đĩa lý thuyết của cột cao hơn hẳn mà không làm tăng áp suất của hệ thống lên.
Ngoài ra, việc sử dụng các cột có độ truyền khối thấp còn cho sử dụng tốc độ dòng cao mà không làm tăng chiều cao của đĩa lý thuyết một cách đáng kể, do đó người sử dụng có thể chọn tốc độ dòng cao trong quá trình chạy để tối ưu thời gian phân tích sắc ký.
Kết luận
Có nhiều cách để tăng hiệu năng của cột sắc ký như giảm kích thước của hạt pha tĩnh hoặc tăng chiều dài cột sắc ký, tuy nhiên thành phần và cấu trúc của cột sắc ký cũng là những cách để tối ưu hiệu năng như việc sử dụng cột có cấu trúc coreshell để giảm quá trình truyền khối.
Nguồn: Dịch tài liệu tổng hợp.
